12分用户案例：circRHOBTB3通过调节HuR介导的PTBP1转录稳定性抑制结直肠癌转移 | m6A专题

论文标题：Circular RNA circRHOBTB3 represses metastasis by regulating the HuR-mediated mRNA stability of PTBP1 in colorectal cancer

刊登日期：2021年06月

发表杂志：Theranostics

影响因子：11.600

研究机构：浙江大学医学院邵逸夫医院结直肠外科，浙江省生物处理重点实验室，浙江大学医学院邵逸夫医院骨科， 

技术手段：转录组测序、联川生物Omicstudio云平台

文章架构：

样本基础信息：

该研究主要使用了83对CRC组织及其相邻的非肿瘤组织，大部分患者年龄大于60岁，未出现明显的肿瘤转移和侵袭现象，且大部分患者的肿瘤直径小于5cm。

主要研究内容：
1. CRC组织中circRHOBTB3的鉴定和表征

图1

首先，该研究基于RNA-seq分析了3对CRC组织和癌旁组织中差异表达的circRNA，筛选出10个候选circRNAs；然后通过qRT-PCR验证，发现其中9个circRNA具有显著的表达差异，其中circRHOBTB3的P值最小、丰度相对较高。

通过分析68对CRC组织和良性组织中circRHOBTB3的表达水平，发现其在59个肿瘤组织中表达降低。然后在83个CRC组织中检测到circRHOBTB3在晚期肿瘤中的表达显著低于早期，表明circRHOBTB3与晚期疾病分期呈负相关。

circRHOBTB3是由RHOBTB3基因的外显子6和7反向剪接形成，并且存在于cDNA中，不存在于gDNA中。FISH表明，circRHOBTB3同时存在于细胞核和细胞质中。

2. CircRHOBTB3在体外抑制CRC细胞迁移和侵袭

图2

为了研究circRHOBTB3在体外CRC 细胞中的功能作用，通过qPCR分析发现circRHOBTB3在正常细胞中的表达量显著高于癌细胞。构建circRHOBTB3过表达细胞株以及沉默细胞株，通过Transwell和创伤愈合方法，发现细胞侵袭和迁移能力分别明显减弱和增强。通过WB发现，过表达或敲除circRHOBTB3分别抑制和促进了CRC细胞转移。

3. circRHOBTB3与HuR蛋白结合，并调节其在CRC中的泛素降解

图3

为了探究circRHOBTB3在CRC细胞转移中的调控机制，作者利用4个数据库（catRAPID，circAtlas，starBase和RBPDB）检索并筛选到3个潜在的circRHOBTB3结合蛋白（SRSF1、FUS和HuR）。通过RNA-pulldown和RIP验证circRHOBTB3与这3个蛋白的结合关系，发现只有HuR与circRHOBTB3相互结合。并且qPCR和WB结果表明，构建circRHOBTB3的过表达或基因敲除株系，可分别抑制和提高HuR的蛋白表达量，而对HuR的mRNA水平没有影响。因此作者假设circRHOBTB3可能调节HuR转录后水平的稳定性。随后作者用CHX处理circRHOBTB3敲除细胞，并与蛋白酶体抑制剂（MG132）或溶酶体抑制剂（氯喹）共处理后，发现MG132能够逆转HuR的泛素化降解，表明circRHOBTB3可能通过UBS途径增强HuR降解。通过构建circRHOBTB3稳转细胞株进一步证实，过表达circRHOBTB3可改善HuR泛素化降解。并通过Co-IP实验，发现过表达circRHOBTB3促进了CRC细胞中HuR和E3泛素连接酶（β-Trcp1）之间的相互作用。上述结果表明circRHOBTB3与HuR相互作用来促进其β-Trcp1介导的泛素化降解。

4. CircRHOBTB3通过HuR / PTBP1轴抑制体外CRC细胞转移

图4

作者通过构建过表达circRHOBTB3稳转细胞系，进行RNA-seq。随后作者通过RAP-CLIP绘制了HuR结合位点，发现有34个基因既被circRHOBTB3抑制，又被HuR蛋白靶向。根据文献和TCGA数据库作者选择了4个候选基因。然后通过qPCR和WB验证，选择了PTBP1和CD44。其中PTBP1主要作用于CRC细胞侵袭，并通过剪接CD44产生侵袭性状。因此作者假设circRHOBTB3降解HuR以影响PTBP1的表达并影响CRC细胞侵袭。 

再次通过qPCR和WB验证，发现过表达或敲除circRHOBTB3分别抑制或增强了PTBP1 mRNA水平；而在CRC细胞中过表达HuR增强了circRHOBTB3上调引起的PTBP1下调，沉默HuR则抑制了circRHOBTB3下调对PTBP1水平的影响。上述结果表明，circRHOBTB3与HuR互作以抑制PTBP1表达。

图5

接着作者通过Transwell、愈伤实验和EMT实验，发现过表达PTBP1能够部分逆转circRHOBTB3上调对细胞迁移、侵袭和EMT的抑制作用，沉默PTBP1后结果相反。

5. 动物实验

图6

作者为了研究circRHOBTB3在体内控制大肠癌转移的作用，通过构建过表达circRHOBTB3或同时过表达circRHOBTB3和PTBP1的稳转细胞株，将细胞通过裸鼠尾静脉植入肺腔。生物发光成像显示过表达circRHOBTB3组荧光素酶活性显著降低，H&E染色结果表明过表达circRHOBTB3组肿瘤形成显著减少，同时过表达circRHOBTB3和PTBP1组在一定程度逆转了这种现象。该部分结果说明circRHOBTB3在体内抑制肿瘤转移。取材病灶部分组织做WB和IHC实验，分别检测HUR、PTBP1和EMT相关蛋白分子，circRHOBTB3组的表达均降低，跟体外细胞结果相一致。

6. circRHOBTB3的产生由FUS和ADARB2组合调节

图7

最后，作者深入研究了circRHOBTB3的环化机制。通过检索circAtlas数据库，发现反作用剪切因子（SFs）FUS可能会与circRHOBTB3的环状外显子两侧的内含子结合，并发现沉默FUS显著抑制了CRC细胞中circRHOBTB3的表达。通过检索ATCG数据库，发现ADARB2在CRC组织中表达降低，并且敲除ADARB2能够抑制circRHOBTB3表达。IHC实验结果表明ADARB2在CRC组织中的蛋白表达水平低于癌旁组织。因此假设FUS和ADARB2都可能参与CRC细胞系中circRHOBTB3的产生。随后作者设计了针对包含FUS结合基序的上下游侧翼序列的4个引物（a-d）和1个针对下游AluY元件的引物。RIP分析后发现FUS与侧翼内含子结合，ADARB2与AluY元件结合。根据以上结果，最终将FUS和ADARB2确定为CRC细胞中circRHOBTB3产生的重要调节剂。

总结

该研究在CRC中确定了一种新的转移相关因子——circRHOBTB3。FUS和ADARB2组合有利于circRHOBTB3的产生。circRHOBTB3通过UBS途径促进HuR泛素化降解，并抑制PTBP1的mRNA稳定性，circRHOBTB3 通过 HuR/PTBP1 轴对CRC侵袭性产生抑制作用。

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